비임상 약물 독성 대사체 스크리닝– LC-MS/MS 기반 Early Toxicity Signal 탐지 전략

 

1. 들어가며: 독성 예측의 패러다임 전환

신약 개발 초기 단계에서의 독성 예측은 임상 실패를 방지하고 개발 비용을 절감하는 데 핵심적인 요소입니다. 기존의 독성 평가는 주로 병리조직학적 변화, 혈액학적 지표, 생화학적 마커 등을 통해 수행되었으나, 이러한 접근법은 일반적으로 "사후적 결과"에 기반하여 약물 투여 후 일정 시간이 경과한 뒤에야 독성을 감지할 수 있다는 한계를 지니고 있습니다.

이러한 제한점을 극복하기 위한 최신 전략 중 하나가 바로 대사체 기반 독성 예측(metabolomics for toxicity prediction)입니다. 특히 LC-MS/MS 기반의 고감도 대사체 분석 기법을 통해 조직 손상이 가시화되기 전에 나타나는 subtle한 분자 수준의 변화를 조기에 포착할 수 있으며, 이를 통해 조기 독성 신호(early toxicity signals)를 탐지하고 잠재적 위험을 평가할 수 있습니다.

비임상 약물 독성 대사체 스크리닝– LC-MS/MS 기반 Early Toxicity Signal 탐지 전략

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2. 대사체 스크리닝의 원리: Why Metabolomics?

2.1 독성과 대사체 변화의 연관성

약물 투여 시 간, 신장, 폐 등 주요 대사기관은 다양한 생리적 스트레스를 경험하게 되며, 이는 곧 내생성 대사 경로의 교란으로 이어집니다. 이러한 교란은 특정 대사체의 과잉 축적 또는 고갈로 나타날 수 있으며, 결과적으로는 세포 항상성(homeostasis)의 붕괴로 연결됩니다.

예를 들어:

• TCA cycle intermediate 감소 → 미토콘드리아 독성
• Bile acid 증가 → 간 담즙 배출 경로 차단 또는 간세포 손상
• SCFA 감소 → 장내 마이크로바이옴 교란

2.2 Targeted vs Untargeted Toxicometabolomics

• Targeted metabolomics: 독성 관련성이 입증된 특정 지표(예: glutathione, taurine 등)를 LC-MS/MS로 정량
• Untargeted metabolomics: 사전 정의된 지표 없이 수백~수천 개의 m/z feature를 탐색해 패턴 기반으로 독성 예측

비임상 단계에서는 대부분 targeted 접근이 선호되며, 분석 정밀도와 규제 대응력을 동시에 고려한 LC-MS/MS 기반 플랫폼이 많이 사용됩니다.

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3. 분석 대상: rat/monkey serum 기반 독성 탐지

3.1 왜 serum인가?

• 접근성 용이: 반복 채혈이 가능하며 동물의 생존에 영향을 주지 않음
• 대사 변화를 체계적으로 반영: 간, 신장 등 주요 장기의 병리적 상태가 혈액에 반영됨
• GLP 환경에 부합하는 분석 플랫폼 구축 가능

3.2 실험 디자인 예시

항목	내용
동물 모델	SD rat 또는 Cynomolgus monkey
투여 약물	저분자 NCE 또는 mAb
용량군	Low / Mid / High + Vehicle control
채혈 시점	Day 0 (baseline), 4h, 24h, Day 7, Day 14
분석 지표	Bile acids, Urea cycle, Acylcarnitines, Purines, Lipidomics

 

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4. LC-MS/MS 기반 Toxicity Biomarker 분석 워크플로우

4.1 Sample Preparation

• 전혈 원심분리 후 serum 분리
• Protein precipitation (MeOH/ACN)
• Internal standard spike (Stable isotope-labeled)
• Dry-down 후 재용해
• 필터링 및 LC vial에 로딩

4.2 LC 조건

항목조건

항목	조건
Column	HILIC 또는 C18
Mobile phase	A: 0.1% FA in Water, B: 0.1% FA in ACN
Gradient	5% B → 95% B (7 min)
Flow rate	0.4 mL/min
Column temp	40°C

 

4.3 MS 조건

항목	조건
Instrument	Triple quadrupole LC-MS/MS
Ionization	ESI (+/-) dual polarity
Acquisition mode	MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Dwell time	15 ms
Scan window	100–1,000 m/z

 

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5. Case Study: 간 독성 예측

5.1 실험 개요

• 목적: 항바이러스 후보물질의 rat 간 독성 예측
• 샘플: Day 0 / Day 4 / Day 7 시점 serum
• 지표 대사체: Bile acids, taurine, methionine sulfoxide, trans-aconitate

5.2 주요 결과

 

Time point	Glycocholic acid (ng/mL)	Taurine (µM)	ALT (U/L)
Day 0	110	42.1	39
Day 4	350 ↑	55.3 ↑	60 ↑
Day 7	630 ↑↑	88.7 ↑↑	165 ↑↑↑

 

→ ALT 상승보다 약 3일 전 bile acid 급증이 관찰되어 early hepatotoxicity signal로 해석 가능

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6. Fragmentation 기반 구조 확인 및 unknown biomarker 탐색

단순 MRM 정량뿐 아니라, MRM-enhanced Product Ion scan 또는 full-scan HR-MS/MS (Orbitrap, QTOF)를 활용하여 unknown signal에 대한 구조 정보 확보 및 candidate biomarker pool 확장도 가능합니다.

예시:

• m/z 234.0976: Positive mode에서 검출된 unknown → MS/MS에서 neutral loss of 43 Da → likely acylated amino acid 계열
• Retention time 및 fragmentation 패턴 비교로 isoleucine-conjugated acylcarnitine로 추정

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7. Toxicity signal의 통계적 검증

• ANOVA 또는 Kruskal-Wallis를 통한 유의성 평가
• ROC curve 분석으로 예측 민감도/특이도 평가
• Partial Least Squares-Discriminant Analysis (PLS-DA)로 그룹 간 대사체 프로파일 분리도 시각화

→ 조기 독성 biomarker로서의 신뢰성 확보

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8. Regulatory Perspective: FDA/EMA의 최신 가이드라인

FDA는 2020년 이후로 biomarker-based early toxicity detection의 중요성을 강조하고 있으며, EMA 또한 ‘nonclinical safety biomarkers’에 대해 exploratory use를 허용하는 입장을 취하고 있습니다. 다만 validation level (qualified vs exploratory use)에 따라 규제 해석이 달라지므로 다음과 같은 구분이 필요합니다.

 

구분	용도	Validation 수준
Qualified biomarker	독성 판단의 1차 근거	GxP-level full validation
Exploratory biomarker	독성 원인 탐색 및 기전 분석	연구 수준 검증 (semi-quantitative도 허용)

 

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9. 향후 전망: Multi-omics 및 AI 기반 조기 독성 예측

• Transcriptomics + Metabolomics 통합 분석으로 독성 메커니즘 규명
• AI 기반 feature selection (e.g., LASSO, random forest)로 중요 대사체 자동 선별
• Digital twin 기술을 접목한 동물모델 예측 엔진 개발

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10. 결론

LC-MS/MS 기반의 대사체 분석은 비임상 단계에서 약물 유래 독성을 조기에 감지하고 예방할 수 있는 강력한 도구입니다. 특히 rat 또는 monkey serum을 활용한 접근은 조직 손상 이전의 미세한 생화학적 변화를 추적할 수 있는 이상적인 모델로 부각되고 있으며, 정량 정확도와 구조 분석 기능을 겸비한 LC-MS/MS 시스템은 독성 스크리닝의 정밀도를 극대화하는 데 필수적입니다.

앞으로의 독성 예측 전략은 단순한 조직학적 지표를 넘어서 분자 수준에서 조기 경고 신호를 포착하고, 이를 기반으로 약물 개발 초기 단계에서 위험성을 사전에 관리할 수 있는 통합 플랫폼으로 진화하게 될 것입니다.