Biological matrix별 ion suppression 비교 연구

Biological matrix별 ion suppression 비교 연구

— 혈장, 전혈, 소변, 조직에서의 LC-MS/MS ion suppression 실무 가이드

LC-MS/MS 기반 바이오애널리틱스에서 ion suppression (또는 enhancement) 은 정량 정확도와 재현성을 해치는 가장 흔한 문제 중 하나다. 같은 분석법을 서로 다른 matrix(혈장, 전혈, 소변, 조직)에 적용하면, matrix에 포함된 성분(지질, 단백질, 염류, 담즙산류, 대사물 등)이 이온화 효율에 미치는 영향이 달라져 같은 화합물이라도 정량 결과가 달라진다. 따라서 matrix별 ion suppression 특성을 체계적으로 비교하고, 그 결과를 바탕으로 분석법(전처리, internal standard 전략, chromatography, MS 설정 등)을 최적화하는 것은 제약사·CRO·임상검사실 모두에게 핵심 과제다.

이 글은 실무자 입장에서 다음을 제공합니다.

1. 비교 연구의 목적과 기대 결과 정리
2. 실험 설계(샘플 수, matrix 종류, QC 패널, spike-in 전략)
3. 표준화된 실험 프로토콜(전처리, LC 조건, MS 조건)
4. Ion suppression/ enhancement 정량화 방법(포스트컬럼 인퓨전, matrix factor, IS-normalized MF)
5. 각 matrix별 예상되는 suppression 원인과 특징(혈장, 전혈, 소변, 조직)
6. 완화 전략(전처리·Chromatography·IS·MS operational)
7. 데이터 해석과 보고 포맷(표·그래프·통계)
8. 실무 체크리스트와 FAQ

1) 연구 목적과 핵심 질문

목적

• 같은 분석 대상(동일 analyte, 동일 농도)을 혈장, 전혈, 소변, 조직 매트릭스에서 측정했을 때 발생하는 ion suppression/ enhancement의 정도 및 패턴을 계량적으로 비교하고, 그 원인과 해결책을 제시한다.

핵심 질문

• 어떤 matrix가 가장 강한 suppression을 보이는가? (정량적 비교)
• suppression의 주 원인은 무엇인가? (지질? 단백? 무기염류? 등)
• 전처리(예: PPT, SPE, SLE, protein removal plate) 중 어떤 방식이 각 matrix에 가장 효과적인가?
• IS(특히 동위원소 표지 IS)의 보정 능력은 matrix별로 어떻게 달라지는가?
• Chromatography (column chemistry, gradient, RT scheduling)로 suppression hotspot을 회피할 수 있는가?

2) 실험 설계 — 비교 연구의 골격

(A) Matrix 선정 및 확보

• Human plasma (K2EDTA): pooled plasma (healthy donors) × 3 lots (lot간 변동성 확인)
• Whole blood (전혈, anticoagulant: K2EDTA): pooled × 3 lots — hematocrit 다양성(30%, 40%, 50%) 반영
• Urine (소변): pooled × 3 lots, creatinine 기준으로 희석/농축 범위 포함
• Tissue (조직 homogenate): rat liver homogenate, mouse kidney homogenate 등 2종 선택 (조직 종류별 차이 평가)
  (가능하면 human tissue는 윤리·비용 문제로 제한, 대체로 animal tissue 사용)

권장: 각 matrix마다 최소 6~10개의 서로 다른 donor/pool을 확보해 biological variability를 반영.

(B) Analyte 선택

• 대표적인 small molecule 4~6종을 선정:
  • hydrophilic: metformin-like
  • mid polarity: acetaminophen-like
  • lipophilic: tacrolimus-like / cyclosporin-like
  • zwitterionic 또는 ionizable: beta-lactam / aminoglycoside
• 각 analyte에 대해 isotopically labeled IS를 준비(가능한 경우) — IS가 없는 경우 structurally related IS 사용

(C) Calibration/QC 및 Spike-in 설계

• Calibration curve: neat solvent matrix (mobile phase)에서 6–8 level
• QC levels: LLOQ, low, mid, high (각 matrix별)
• Spike-in: 각 matrix에 mapping된 QC 농도로 analyte spike (post-extraction spiking도 수행)
• Matrix factor (MF) 실험 필요: neat solution vs pre-extracted matrix vs post-extracted spiked matrix

(D) Replicates & Statistics

• 각 condition(전처리 방식 × matrix × analyte)마다 n=6 technical replicates 권장
• 통계: mean, SD, CV(%) 계산, ANOVA 또는 Kruskal-Wallis로 matrix 간 차이 검정

3) 표준화 프로토콜 (실무용 — copy/paste 가능)

아래 프로토콜은 비교 연구용 기본 템플릿입니다. 실험실 장비와 장치 사양에 맞춰 세부 파라미터(원심분리 rpm, vortex 시간 등)를 조정하세요.

(A) Reagents & Consumables

• LC-MS grade Methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN), Water
• Formic acid (FA) 0.1% 또는 Ammonium formate buffer
• IS stock in MeOH (stable isotope labeled)
• PPT plates, phospholipid removal plates (HybridSPE-Phospholipid), 96-well SPE plates (mixed mode), SLE plates, Oasis HLB etc.

(B) Sample preparation workflows (parallel 비교)

Workflow 1 — Protein Precipitation (PPT)

1. Aliquot 50 µL plasma/urine/homogenate/whole blood into 96-well plate.
2. Add 10 µL IS working solution.
3. Add 200 µL cold ACN (vortex 1 min).
4. Centrifuge 4000 g, 10 min.
5. Transfer supernatant (150 µL) → dilute with water if necessary → inject.

Workflow 2 — PPT + Phospholipid removal (HybridSPE)

1–3. PPT same as above but transfer supernatant to HybridSPE plate, apply positive pressure, collect eluate.
4. Evaporate under N2 (if required) → reconstitute in mobile phase → inject.

Workflow 3 — 96-well SPE (mixed mode, HLB or MCX)

1. Condition SPE plate (MeOH, water).
2. Load sample (after protein precipitation or direct load with dilution).
3. Wash (aqueous wash, then organic wash).
4. Elute with MeOH + 1% FA or MeOH + 5% NH4OH depending on sorbent.
5. Evaporate & reconstitute → inject.

Workflow 4 — SLE (Supported Liquid Extraction)

1. Load sample onto SLE plate.
2. Wait (partitioning) then elute with ethyl acetate or DCM/MeOH mix.
3. Evaporate & reconstitute → inject.

Workflow 5 — Tissue homogenate specific

1. Homogenize tissue in 3× volume of PBS (or 50:50 MeOH:Water) using bead mill.
2. Protein precipitation or homogenate dilution + SPE as above.
3. Clarify & inject.

주의: 전혈(whole blood)은 hematocrit 관련 영향 고려(볼륨 교정/사전 희석). 전혈 PPT는 hemoglobin 관련 matrix effect 심함.

(C) LC conditions (최소 조건)

• Column: 50 × 2.1 mm, 1.7 µm C18 (혹은 biphenyl for aromatic)
• Mobile A: Water + 0.1% FA, Mobile B: ACN + 0.1% FA
• Flow: 0.4 mL/min, Column temp: 40°C
• Gradient (예시): 5% B (0–0.2 min) → 95% B (0.2–1.5 min) → re-equilibration 2.0 min
• Injection: 2–5 µL (matrix dependent)

(D) MS/MS conditions (Triple Quad)

• Ionization: ESI positive/negative per analyte
• MRM transitions: optimized precursor → product
• Dwell: scheduled MRM (window ±0.2 min)
• Source: CUR, GS1, GS2, ion spray voltage, temperature tuned per instrument

4) Ion suppression 측정 방법 — 정량화 절차

(A) Post-column/post-column infusion (Classical 방식)

• 일정 농도의 analyte (or probe compound) 표준을 LC 유입구 뒤로 지속적으로 주입(post-column infusion)
• Blank matrix extract을 연속 주입하면서 전체 크로마토그램에서 signal intensity 변화를 관찰
• suppression이 발생하면 infusion signal이 떨어지는 구간이 나타남 → suppression hotspot 파악

장점: suppression 현상 위치(시간) 시각화 가능
단점: 정량 수치 제공 X, 복수 analyte 동시 관찰은 제한적

(B) Matrix Factor (MF) — 정량적 방식 (권장)

• MF = (Peak area of analyte spiked post-extraction in matrix) / (Peak area of analyte in neat solution at same nominal concentration)
• IS-normalized MF = MF_analyte / MF_IS

실험군:

1. Neat standard in mobile phase (A)
2. Neat standard spiked into post-extracted blank matrix (B)
3. Pre-extraction spiked matrix (C) — to assess recovery
4. Calculate MF at low and high QC levels. MF < 0.85 → suppression, MF > 1.15 → enhancement (thresholds per guidance).

장점: 수치화, 통계적 비교 가능
권장: 각 matrix × 전처리 조건마다 MF 계산 (n≥6)

(C) IS-normalized result 분석

• IS의 역할: matrix effect와 전처리 변동을 보정
• 가장 권장되는 검증: IS-normalized MF close to 1.0 (±15% 허용)

5) 각 matrix별 suppression 특성 및 예상 원인 (요점 정리)

혈장 (Plasma)

• 주요 원인: phospholipids (PC, PE 등), endogenous lipids, albumin binding, bile acids, salts
• 특징: phospholipid-induced suppression이 LC-MS에서 가장 흔함. suppression hotspot은 주로 중간 RT(≈1.0–3.0 min)에 나타남.
• 완화 전략: phospholipid removal plate, SPE with phospholipid trapping, chromatographic separation (phospholipid retention zone 피하기), stable isotope IS.

전혈 (Whole blood)

• 주요 원인: hemoglobin, cell debris, lipids, high protein content, hematocrit-related viscosity 변화
• 특징: 전혈은 혈장보다 suppression 강도와 변동성이 큼. hematocrit 변화(30→60%)에 따라 spot/volume 기반 sample (DBS)에서는 양적인 차이가 크게 남.
• 완화 전략: microsampling 보정(hematocrit correction), 강력한 clean-up (SPE), centrifugation 조건 최적화, 전혈 전처리 시 dilution factor 확보.

소변 (Urine)

• 주요 원인: 높은 무기염류(염분), creatinine, urea, steroid conjugates, variable pH
• 특징: 소변은 matrix가 덜 복잡해 보이지만, 염류·pH 차이가 ionization에 큰 영향. 농축된 urine sample은 suppression 또는 enhancement를 모두 보여줄 수 있음.
• 완화 전략: dilution (creatinine normalization), pH 조정, desalting (SPE), isotope IS 보정.

조직 (Tissue homogenate)

• 주요 원인: complex lipidome, phospholipids, endogenous metabolites, detergents (if used), variable protein content
• 특징: tissue 종류(간 vs 신장 vs 뇌)에 따라 suppression 패턴이 극단적으로 다름. liver는 대체로 지질 및 담즙산으로 인해 강한 suppression.
• 완화 전략: tissue-specific extraction (liquid-liquid extraction or biphasic Bligh & Dyer), phospholipid removal, tandem cleanup (PPT → SPE), matrix-matched calibration or standard addition.

6) 완화 전략 상세 — 실무 팁

전처리 전략

1. Phospholipid removal: HybridSPE-Phospholipid plate 혹은 phospholipid trapping SPE — plasma/tissue에서 유효.
2. SPE (mixed-mode): HLB (reversed + polar retention) 또는 mixed-mode (ion exchange + reversed) → 지질성분 제거 우수.
3. SLE: 단순한 PPT 대비 cleaner eluate 제공.
4. Dilution approach: matrix dilution (1:3–1:10)로 matrix effect 완화 (LOQ가 감도 한도를 만족할 때).
5. Protein precipitation + phospholipid trap: 비용·속도·성능 균형에서 많이 쓰임.

Chromatography 전략

1. Retention scheduling: suppression hotspot을 회피하도록 analyte RT 조절 (예: phospholipid가 주로 용출되는 구간 피함).
2. Column chemistry: biphenyl/phenyl-hexyl은 지질과 상호작용을 달리해 이점을 줄 때가 있음. HILIC은 매우 극성 분자를 다루는 데 유리.
3. Guard column/Filtering: high load 시 가드카트리지 사용으로 column contamination 억제.

MS 운영 전략

1. Stable isotope labeled IS (SIL-IS): analyte와 동질적인 ionization 및 fragmentation behavior를 가지므로 matrix effect 보정에서 가장 강력.
2. Scheduled MRM & narrow windows: dwell time 향상과 background noise 감소에 도움.
3. Source conditions 최적화: curtain gas, nebulizer 기체, temperature를 조정해 건조 및 이온화 효율을 올림.
4. Source cleaning & maintenance 주기: dirty matrix 다루는 경우 source contamination이 빨리 발생하므로 주기적 세척·교체 필요.

Calibration strategy

1. Matrix-matched calibration: matrix effect가 크면 matrix matched curve 사용
2. Standard addition: 심하게 variable한 matrix에서는 standard addition법으로 정확도 보장(실무 비용 높음)
3. IS-normalized MF 확인: 정기적으로 MF와 IS-normalized MF를 모니터링

7) 데이터 해석과 보고 구성 — 권장 포맷

(A) 요약 표 (예시)

 

Matrix	전처리법	MF (low QC)	MF (high QC)	IS-normalized MF	CV (n=6)	권장 여부
Plasma lot A	PPT	0.62	0.68	0.98	6.5%	PPT+HybridSPE 권장
Whole blood lot A	PPT	0.45	0.50	0.70	18%	SPE 권장
Urine lot A	Dilution 1:5	0.95	1.02	0.99	4.1%	Dilution OK
Liver homogenate	PPT+SPE	0.55	0.60	0.92	12%	PPT+SPE 권장

(B) 그래프

• Post-column infusion trace: suppression hotspot 시각화
• MF boxplot per matrix: matrix 간 분포 비교
• IS-normalized MF time trend: run간 drift 모니터링
• PCA on peak areas for QC clustering: matrix간 bias 시각화

(C) 통계 처리

• MF comparison: ANOVA (matrix effect 유의성)
• CV comparison: Kruskal-Wallis if nonparametric
• Boundary 조건: MF outside 0.85–1.15 flagged

8) 실무 체크리스트 (현장용)

실험 전

• matrix lots 확보(≥3)와 donor 정보 기록
• analyte & IS purity, storage lot 기록
• spike-in protocol (pre vs post) 확정
• 전처리 장비·plate lot 확보

실험 중

• 각 전처리법마다 n≥6 replicate 실행
• post-column infusion for at least one run per matrix
• blank & solvent run 전후로 injection (carryover 확인)
• IS-normalized MF 계산 & 기록

실험 후

• MF, IS-normalized MF, CV 계산 및 report
• suppression hotspot RT 기록 & chromatographic mitigation 제안
• 전처리 SOP 업데이트 (matrix별 권장법)
• QC rule에 MF 모니터 항목 추가 (예: weekly check)

9) 자주 묻는 질문 (FAQ)

Q1. IS가 있으면 모든 matrix effect가 해결되나요?
A1. 대부분의 경우 SIL-IS는 매우 효과적이지만 100% 해결은 아니다. IS가 analyte와 retention/fragmentation이 완전 일치하지 않거나 IS 자체도 matrix에 민감하면 보정 한계가 있다. 또한 IS-normalized MF가 1.0에 가깝더라도 전처리 recovery가 낮으면 accuracy 문제는 남는다.

Q2. Post-column infusion은 필수인가요?
A2. suppression hotspot 위치 파악을 위해 필수적이다. 특히 새로운 matrix나 변경된 전처리/column이 도입될 때마다 한 번은 수행하는 것을 권장한다.

Q3. 소변은 항상 dilution으로 해결할 수 있나요?
A3. dilution은 간단한 방법이지만 결과적으로 LOQ가 올라간다. analyte가 낮은 농도라면 desalting(SPE)이나 pH 조정이 필요하다.

Q4. tissue homogenate는 어떤 전처리가 베스트인가요?
A4. tissue 종류마다 다르다. Liver는 지질이 많으므로 PPT 후 SPE 또는 Bligh & Dyer biphasic extraction를 권장한다.

10) 결론 — 실무자의 관점에서

• Matrix별 ion suppression은 정성적(원인)·정량적(MF)으로 반드시 평가해야 한다.
• Stable isotope labeled internal standard가 최우선 권장이지만, IS만으로 모든 문제를 해결할 수는 없다.
• 전처리 설계(특히 phospholipid 제거)와 chromatography 최적화가 실효성 높은 해결책이다.
• post-column infusion + MF(정량) 조합으로 suppression의 위치·크기·전처리 효과를 객관화하라.
• Matrix-matched calibration 또는 standard addition은 최후의 보루지만 운영비용과 시간 부담이 크다 — 프로젝트 상황에 따라 전략적 선택이 필요하다.