Endogenous Metabolite Interference 최소화를 위한 방법 개발 전략

― “표준물질은 잘 나오는데, 왜 실제 샘플만 흔들릴까?”라는 질문에 대한 답

LC-MS/MS 기반 bioanalysis를 오래 해본 분석자라면,
누구나 비슷한 경험을 해봤을 것이다.

• neat solution에서는 감도도 좋고 직선성도 완벽하다
• stripped matrix에서도 validation은 무난히 통과한다
• 그런데 실제 biological sample을 넣는 순간,
  • baseline이 흔들리고
  • 예상치 못한 피크가 튀어나오고
  • low concentration에서 재현성이 무너진다

이 현상의 중심에는 거의 항상
endogenous metabolite interference가 있다.

이 문제는 단순히 “matrix effect”라는 한 단어로 설명하기엔 너무 복잡하고,
“더 세게 씻자”거나 “컬럼을 바꾸자”는 접근만으로는 해결되지 않는다.

이 글에서는
endogenous metabolite interference가 왜 발생하는지,
어디에서 가장 심각해지는지,
방법 개발 단계에서 어떻게 구조적으로 줄일 수 있는지를
분석팀 실무자 시선으로 차분히 정리한다.

1. Endogenous interference란 무엇인가?

1.1 단순한 co-elution 문제가 아니다

많은 경우 endogenous interference는
다음과 같이 단순화되어 설명된다.

“비슷한 retention time에 endogenous compound가 같이 나왔다.”

하지만 실제로는 훨씬 복합적이다.

• 동일한 precursor m/z
• 유사한 fragment ion
• in-source fragmentation
• isobaric compound
• matrix-induced ionization enhancement/suppression

즉, interference는
크로마토그래피 문제 + 질량분석 문제 + 샘플 특성 문제가
겹쳐서 나타난다.

1.2 왜 endogenous metabolite가 더 위험한가

Endogenous metabolite는 다음 특성을 가진다.

• 농도 범위가 넓다 (µM ~ mM)
• 개인차·질환 차이가 크다
• 외부에서 제거하기 어렵다
• 구조적으로 분석 대상과 유사한 경우가 많다

특히 drug-like compound,
endogenous biomarker,
steroid, lipid, bile acid 계열에서 문제가 심각하다.

2. Interference가 가장 많이 발생하는 상황

2.1 Low concentration 영역

• LLOQ 근처
• TDM trough level
• late PK time point

이 영역에서는
endogenous background가 signal 자체를 삼켜버리거나,
반대로 false positive처럼 보이게 만든다.

2.2 Polar compound 분석

• amino acid derivative
• small polar drug
• conjugated metabolite

극성 화합물은
내인성 대사체와의 overlap 가능성이 매우 높다.

2.3 조직·전혈·CSF

혈장보다 훨씬 복잡하다.

• 조직: lipid, phospholipid 폭증
• 전혈: hemoglobin, RBC-derived compound
• CSF: low analyte + low background의 역설

3. 방법 개발 단계에서의 핵심 전략

3.1 “LC로 최대한 분리하라”는 여전히 유효하다

아무리 MS가 좋아져도,
interference 해결의 1차 책임은 LC다.

(1) Retention time 확보

• 너무 빠른 RT (<1 min)는 위험 신호
• gradient 초반부는 endogenous 폭탄 지대

가능하다면:

• analyte RT를 2–4 min 이상 확보
• solvent front와 거리 두기

(2) Column chemistry 재검토

다음과 같은 접근이 효과적인 경우가 많다.

• C18 → C8, phenyl-hexyl
• polar analyte → HILIC 또는 mixed-mode
• steroid → biphenyl, C30

컬럼을 바꾸는 것은 귀찮지만,
interference 문제에서는 가장 확실한 해결책이 될 수 있다.

3.2 Sample preparation에서의 전략적 선택

(1) Protein precipitation만으로 충분한가?

PP는 빠르고 편하지만:

• endogenous metabolite 대부분이 그대로 남는다
• phospholipid, bile acid 제거 한계

interference가 심하다면:

• SPE 또는 hybrid SPE 고려
• 최소한 phospholipid removal plate 검토

(2) SPE는 ‘선택성’이 핵심이다

SPE를 쓸 때 흔한 실수는:

“회수율이 좋은 조건”만 찾는 것

하지만 interference 관점에서는:

• recovery 70% + clean extract가
• recovery 95% + dirty extract보다 낫다

특히 mixed-mode SPE는:

• charge 기반 분리로 endogenous 제거에 효과적

3.3 Derivatization의 전략적 활용

분석팀이 종종 피하고 싶어 하는 선택지지만,
interference 문제에서는 매우 강력하다.

• 극성 compound → retention 증가
• 구조 변화 → endogenous overlap 감소
• sensitivity + selectivity 동시 개선

amine, carbonyl, steroid 계열에서
derivatization은 “최후의 수단”이 아니라
현실적인 해결책인 경우가 많다.

4. MS/MS 조건에서의 interference 최소화

4.1 Precursor 선택 재검토

• [M+H]+만 고집하지 말 것
• [M+Na]+, [M+NH4]+ 고려
• negative mode 전환도 옵션

endogenous interference는
종종 특정 adduct에서만 심하다.

4.2 Quantifier ion을 다시 보자

가장 흔한 함정:

“가장 강한 fragment = quantifier”

하지만 interference 관점에서는:

• 덜 강하지만 더 특이적인 fragment가
  더 좋은 quantifier일 수 있다.

Multi-quantifier ion 전략은
이 지점에서 큰 힘을 발휘한다.

4.3 Ion ratio monitoring의 적극 활용

• calibration에서는 괜찮은 ratio
• 실제 sample에서 ratio 붕괴

이 자체가 interference의 신호다.

validation 단계에서:

• 다양한 individual matrix로 ion ratio 평가 필수

5. Internal standard(IS)의 역할 재정의

5.1 IS가 있다고 다 해결되지는 않는다

Isotopically labeled IS는 강력하지만:

• co-eluting interference에는 무력
• in-source fragment에는 대응 불가

IS는:

• 보정 도구이지, 방패가 아니다

5.2 Position-specific labeling의 중요성

가능하다면:

• deuterium 위치가 fragmentation에 영향을 주지 않도록 설계
• exchangeable hydrogen 회피

잘못된 IS는
오히려 데이터를 더 혼란스럽게 만든다.

6. Validation 단계에서의 전략적 평가

6.1 Matrix selectivity는 ‘형식적 시험’이 아니다

ICH M10 기준의 6 lot matrix 테스트는
최소 조건일 뿐이다.

실무에서는:

• disease matrix
• high lipid sample
• hemolyzed sample

까지 고려해야
실제 interference를 예측할 수 있다.

6.2 LLOQ에서의 집요함

대부분의 interference 문제는
LLOQ에서 터진다.

• blank response <20% 규정 충족 여부
• 실제 blank의 variability 확인

규정만 통과했다고 안심하면
실제 sample에서 무너진다.

7. Endogenous biomarker 분석에서의 특별 고려사항

Drug 분석보다 더 어렵다.

• true blank가 존재하지 않음
• 개인차가 interference처럼 보일 수 있음

이 경우:

• surrogate matrix 전략
• standard addition approach
• relative quantification 고려

“정량”의 정의 자체를
현실에 맞게 재설정해야 한다.

8. 분석팀 실무자용 체크리스트

방법 개발 단계

• RT가 solvent front에서 충분히 떨어져 있는가
• 컬럼 chemistry를 충분히 탐색했는가
• PP 외 전처리 옵션을 검토했는가

MS 조건

• precursor/adduct 선택 근거가 있는가
• quantifier ion의 특이성을 검토했는가
• ion ratio robustness를 평가했는가

Validation

• 다양한 matrix에서 selectivity 확인
• LLOQ에서 blank variability 평가
• disease matrix 고려 여부

실제 분석

• unexpected peak 발생 시 구조적 원인 분석
• 단순 재분석보다 method 문제 의심

9. 결론: Endogenous interference는 ‘피할 대상’이 아니라 ‘관리 대상’이다

Endogenous metabolite interference는
LC-MS/MS 분석에서 피할 수 없는 현실이다.

중요한 것은:

• 없애려는 집착이 아니라
• 예측하고, 줄이고, 통제하는 전략이다.

좋은 방법 개발자는
“가장 깨끗한 chromatogram”을 만드는 사람이 아니라,
“실제 biological sample에서도 흔들리지 않는 분석법”을 만드는 사람이다.

Endogenous interference를 정면으로 다루기 시작할 때,
당신의 LC-MS/MS 방법은
비로소 연구용을 넘어 개발용 분석법이 된다.

Endogenous Metabolite Interference 최소화를 위한 방법 개발 전략