Isotopically Labeled Internal Standard의 선택 기준과 실제 적용 사례

― LC-MS/MS 정량 분석의 신뢰도를 결정하는 핵심 요소

1. 왜 우리는 “IS(Internal Standard)” 중에서도 Isotopically Labeled IS를 찾게 되는가

LC-MS/MS 기반 정량 분석을 처음 접한 사람에게 가장 먼저 가르치는 원리는
“모든 분석에는 반드시 Internal Standard가 필요하다”는 단순한 명제이다.

하지만 실제 프로젝트를 맡아보면 곧 깨닫게 된다.
이 분석이 왜 이렇게 요동치는지, 신호가 왜 이런 식으로 눌리는지,
그리고 QC accuracy가 85–115% 사이에서 안정적으로 잡히지 않는 이유가
단순히 sample prep 숙련도 때문이 아니라 IS 선택 문제일 수 있다는 사실을.

특히 protein precipitation(PPT), SPE, LLE, phospholipid-rich matrix,
그리고 nanogram 단위 ultra-trace quantification에서는
IS의 선택 하나가 분석의 전체 reproducibility를 좌우한다.

많은 사람들이 “structural analog IS면 충분하다”고 생각하지만,
실무에서는 대부분 isotopically labeled internal standard(ILIS) 없이는
long-term stability, batch-to-batch reproducibility, matrix effect 보정,
그리고 instrument drift 보정을 만족시키기 어렵다.

결국, ILIS는 LC-MS/MS bioanalysis의 “보험”과도 같은 존재이다.

2. Isotopically Labeled IS란 무엇인가: 단순한 동위원소 치환 이상의 의미

ILIS는 기본적으로 분석 대상 화합물과 구조가 동일하면서도
일부 원자를 안정 동위원소로 치환한 화합물이다.

일반적으로 사용되는 동위원소는

• Deuterium (²H 또는 D)
• Carbon-13 (¹³C)
• Nitrogen-15 (¹⁵N)
• Oxygen-18 (¹⁸O)

이 중에서 국내 제약사 분석팀이 가장 많이 사용하는 것은 D-labeled IS이며,
다음으로 ¹³C-labeled IS가 꼽힌다.

ILIS의 장점은 명확하다.

• 물리·화학적 특성이 real analyte와 동일 → sample prep 손실 동일하게 반영
• matrix effect에 대해서도 동일하게 suppress/ enhance됨
• ionization efficiency 차이가 거의 없음
• chromatography에서 거의 동일하게 움직임
• MRM(multiple reaction monitoring) transition을 통해 정확히 구분 가능

즉, ILIS는 실제 analyte의 또 다른 분신과 같다.

3. ILIS 선택 기준 7가지 ― 많은 분석자들이 놓치는 디테일

1) Labeled position의 안정성(critical)

가장 중요한 기준이다.

Deuterium-labeled IS의 대표적 문제는 다음과 같다.

• D ↔ H back-exchange 가능
• mobile phase 내 protic environment에서 D가 쉽게 교환
• acidified mobile phase 사용 시 특히 취약
• retention shift 발생 가능

따라서 D가 exchangeable functional group에 붙어 있는지 반드시 확인해야 한다.
예를 들어, 벤젠 링에 D를 치환한 경우는 비교적 안정하지만,
amine 또는 hydroxyl 주변에 D가 있으면 교환 가능성이 매우 높다.

¹³C- 또는 ¹⁵N-labeled IS는 가장 안정적이며,
실무에서는 가능한 경우 ¹³C-labeled가 최고의 선택이다.

2) Mass shift(m/z 차이)는 최소 +3 이상 확보

Mass offset이 너무 작으면 다음 문제가 발생한다.

• natural isotopic abundance peak와 겹침
• 상대적으로 낮은 스펙트럼 분리도
• noise 간섭

따라서 보통은 +3, +4, +5 Da 이상 차이가 확보되도록 설계하는 것이 일반적이다.

D-labeled의 경우 +3~6쳐서 확보하는 것이 실무에서 안전하다.

3) Chromatographic co-elution 여부 필수 확인

대표적 착각 중 하나:

“ILIS는 구조가 같으니까 무조건 같은 RT를 가진다.”

현실은 다르다.
특히 Deuterium labeling은 hydrophobicity를 미세하게 변화시키며,
gradient LC 조건에서는 RT shift(몇 초~수십 초)가 발생한다.

RT shift는 method validation 시 다음 문제를 야기한다.

• matrix effect 차이 발생
• ion suppression 보정 실패
• true analyte recovery 반영 불가

실무 규칙:
Co-elution mismatch ≥ 0.02–0.03 min이면 불합격
(고처리량 short gradient에서는 더 엄격하게 적용)

4) Fragmentation pathway 동일성

MRM transition이 analyte와 동일해야 한다.

만약 fragmentation pattern이 다르면
“분자 구조는 같지만 분해 방식이 다른 가짜 분신”이 되는 셈이다.

¹³C-labeled 또는 ¹⁵N-labeled는 fragmentation pathway가 거의 동일하나,
D-labeled IS에서는 collision-induced dissociation 시
fragment 위치에 따라 다른 패턴이 나오는 경우가 있다.

따라서 반드시 실험적으로 확인해야 한다.

5) IS concentration 적합성 (Detector saturation 회피)

분석 전용 내부 보고서에서 매우 자주 등장하는 문제:

• IS concentration이 너무 높아서는 안 된다.
• MRM dwell time 조절 시 detector saturation 발생 가능
• 특히 compact orbitrap 기반 HRMS quantification에서는 saturation가 치명적

실무 기준:

• IS peak area는 analyte mid QC와 유사한 range
• 너무 강한 IS는 peak shape 왜곡
• 너무 약한 IS는 noise 영향 증가

6) Chemical purity & isotopic purity 확인

좋은 ILIS는 두 가지 purity를 제공한다.

 

종류	의미	실무 영향
Chemical purity	일반 불순물	RT shift, split peak, noise
Isotopic purity	label 비율이 98% 이상인지	unlabeled contamination → analyte와 peak 중첩

특히 ILIS 내 unlabeled 성분이 1–3% 포함되면
LLOQ accuracy가 크게 흔들리므로 사전에 purity certificate 확인이 필수다.

7) Cost vs Benefit

¹³C-labeled는 이상적이지만 단가가 비싸다.
D-labeled는 싸지만 risk가 크다.

실무에서는 보통 다음과 같이 결론 난다.

• 초기 screening, scouting phase → D-labeled
• late phase clinical bioanalysis → ¹³C-labeled
• trace, nanogram analysis → 반드시 ¹³C-labeled

한국 제약사는 비용 문제 때문에 early 단계에서 D-labeled를 많이 사용하지만,
진지한 프로젝트일수록 결국 ¹³C-labeled로 바꾸는 경우가 많다.

4. 실제 적용 사례 5가지 ― 실무 감각에 기반한 예시

사례 1. Peptide류 약물의 IS 선택 문제

국내 한 제약사에서 peptide drug quantification을 진행할 때,
D-labeled analog를 사용했는데 다음 문제가 발생했다.

• RT shift 약 +0.03~0.05분
• MS response 차이 증가
• LLOQ precision 불충족

원인은 D-labeling 위치 특이성 때문이었다.
최종적으로 ¹³C6-labeled amino acid를 기반으로 한
¹³C-labeled peptide IS로 변경하자 모든 문제가 해결되었다.

사례 2. Highly lipophilic analyte quantification에서 matrix effect 보정 실패

대표적인 high MW lipophilic compounds의 경우
plasma phospholipid suppression 영향이 큰데,
D-labeled IS는 RT mismatch로 suppression zone에 정확히 들어가지 못했다.

결과적으로:

• analyte suppression 40–50%
• IS suppression 20–25%

즉, suppression 비율 차이가 너무 커 accuracy가 계속 흔들렸다.

¹³C-labeled IS로 교체하자 suppression 패턴이 완전히 일치하며
precision이 개선되었다.

사례 3. HRMS 기반 quantification에서 D-labeled IS의 fragmentation mismatch

Orbitrap 기반 quantification에서는 MS2 fragmentation가 매우 중요하다.
그러나 D-labeled IS는 일부 fragment에서 D가 빠지고
H-carryover가 발생해 정확한 intensity ratio가 잡히지 않았다.

→ 결국 ¹³C·¹⁵N-labeled IS를 도입하면서 해결.

사례 4. Nanogram-level quantification에서 isotopic purity 문제

ILIS 내 unlabeled 성분이 2% 정도 포함된 D-labeled IS를 사용했는데
LLOQ가 analyte 0.1 ng/mL 수준으로 매우 낮았다.

이 경우,

• IS로부터 발생한 unlabeled contamination peak가 analyte LLOQ 신호를 침식
• LLOQ precision 실패

Isotopic purity ≥ 99% ¹³C-labeled IS로 교체하며 문제 해결.

사례 5. metabolite quantification에서 ILIS 선택 불가능 사례

일부 대사체는 labeled IS가 존재하지 않는다.
실제로 glucuronide, sulfate 대사체는 비용과 합성 난이도로 인해
¹³C-labeled glucuronide 기준체를 구하기 어렵다.

이 경우 방법은 다음과 같다.

• aglycone analyte의 ILIS 사용 (대신 bias 증가 가능성)
• stable isotope dilution assay(SIDA) 방식 적용
• enzyme treatment 후 metabolite quantification

이처럼 ILIS가 없어도 분석은 가능하지만 reproducibility는 한계가 있다.

5. ILIS 선택 시 발생하는 흔한 실무 실수 10가지

1. D-labeling 위치를 확인하지 않음
2. RT co-elution mismatch를 무시함
3. fragmentation pathway 동일성 검증 생략
4. IS concentration이 지나치게 높거나 낮음
5. isotopic purity certificate 확인하지 않음
6. mass shift가 +1 또는 +2 Da 정도로 너무 낮음
7. SPE·LLE 회수율이 analyte와 다르게 나타났는데도 방치
8. matrix effect suppression 구역이 다르게 나타나는 것 인지하지 못함
9. mobile phase 조건 변화에 따른 ILIS stability 검토 부족
10. IS contamination (carryover) 존재 여부 확인 생략

이 실수의 대부분은 IS가 “그냥 자동으로 analyte 보정을 잘 해주는 도구”라는
지나친 신뢰 때문에 발생한다.

6. 정리 ― 좋은 ILIS는 분석의 뿌리를 단단하게 한다

LC-MS/MS bioanalysis에서 isotopically labeled IS는
단순한 reference molecule이 아니라 분석의 신뢰도를 지탱하는 중심축이다.

좋은 ILIS 선택은 다음을 보장한다.

• matrix effect 보정 정확성
• sample prep variability 보정
• instrument drift 보정
• batch 간 RT variation 완화
• LLOQ precision 확보
• long-term reproducibility
• method validation 성공률 상승

특히 late phase bioanalytical method validation에서는
¹³C-labeled IS 사용이 사실상 필수에 가까워지고 있다.

결국, 분석의 퀄리티는 장비가 아니라
IS 선택 하나에서 결정되기도 한다는 사실을
실무자들은 경험을 통해 자연스럽게 깨닫게 된다.

 

Isotopically Labeled Internal Standard의 선택 기준과 실제 적용 사례