Derivatization 기반 분석 감도 개선 전략

– amine, carbonyl, steroid 계 분석 감도·선택성 향상을 위한 실무형 접근

Derivatization 기반 분석 감도 개선 전략

LC-MS/MS 기반 분석에서 감도는 언제나 가장 현실적인 고민이다. 특히 신약 후보 물질처럼 낮은 농도로 존재하는 분석 대상이나, 내인성 대사체처럼 background 간섭이 많은 타깃을 분석할 때는 “현 시스템에서 감도를 얼마나 더 끌어올릴 수 있는가?”가 가장 중요한 문제로 떠오른다.

현장에서 가장 자주 활용되는 감도 향상 전략 중 하나가 바로 derivatization(유도체화) 이다. 유도체화는 단순히 “피크를 키워주는 보조 기법” 정도로 오해되기도 하지만, 실제로는 이온화 효율 개선, 크로마토그래피 분리 향상, 선택성 증가, matrix effect 감소 등 여러 효과가 동시에 나타나는, 분석자가 주도적으로 설계하는 적극적 개입 기법이다.

이번 글에서는 amine, carbonyl, steroid 계 분석물질을 중심으로, 실무에서 바로 적용할 수 있는 유도체화 전략과 국내 제약사 분석팀이 고려해야 할 체크포인트를 하나씩 정리해본다.

1. 왜 derivatization인가?

MS 기반 분석이 보편화된 이후 “derivatization은 GC-MS나 하는 것”이라는 인식이 있었지만, 최근 LC-MS/MS에서도 다시 주목받는 이유는 다음과 같다.

1) 이온화 효율 증가

많은 분석물질은 구조적으로 이온화되기 어려운 부분이 있다.
예를 들어:

• 비극성 스테로이드(hydrocortisone, testosterone 등) → ESI에서 이온화 효율 낮음
• 일부 carbonyl 계 대사체 → enol 형태로 존재해 불안정
• amine 계 → 양이온이긴 하나 이온화 경쟁이 많고 matrix 간섭이 큰 경우가 많음

유도체화를 통해 전하 도입 또는 고이온화성 작용기를 붙이면 감도는 3배~100배까지 개선될 수 있다.

2) 크로마토그래피 분리 개선

특히 구조적으로 유사한 대사체가 여러 개 존재할 때,
예) 스테로이드 계: 11β-OH, 17-OH, 21-OH 등
→ retention, polarity가 유도체화 후 크게 달라져 분리가 용이해진다.

3) Matrix effect 감소

유도체화 후 retention time이 이동하면서 고농도 matrix가 나오는 구간을 피할 수 있는 경우가 많다.
실제로 국내 제약사 분석팀에서 흔히 보고되는 matrix effect 문제(약물:plasma = 1:10⁵ 수준)는 유도체화를 통해 상당 부분 해소된다.

2. Amine 계 분석물질: 전형적인 PITC, FMOC, dansyl chloride 전략

amine 계 분석물질은 기본적으로 양이온 형성이 쉽지만, matrix에서 경쟁이 많아 감도가 기대보다 낮은 경우가 많다. 대표적 유도체화 시약은 다음과 같다.

2.1 Dansyl chloride: fluorescence + MS 감도 증가의 대표 사례

특징

• amine, phenol, thiol 등 nucleophilic group과 반응
• 강한 화학적 안정성 확보
• ESI(+)/APCI에서 모두 강한 신호
• UV/fluorescence와 LC-MS를 동시에 활용할 수 있는 장점

장점

• 친환경적이며 부산물 적음
• matrix effect 유의하게 개선됨
• multi-analyte 환경에서도 안정적

실무 팁

• 반응 시간: 30~40분 (45°C) 권장
• carbonate buffer(pH 9–10) 사용 시 반응 속도 증가
• 반응 후 quenching을 충분히 하지 않으면 background noise 증가

국내 제약사 활용 예

• 항정신병 약물(amine-rich structure) LC-MS/MS assay 감도 10배 개선
• 생체 시료 TDM에서 LLOQ 0.2 ng/mL → 0.02 ng/mL 개선 사례 존재

2.2 FMOC-Cl: 중등도 반응성 + 안정적 fragment ion

특징

• ESI(-) 기반 분석에도 강함
• 스테로이드 아미노 대사체 분석에 널리 사용
• pH 8–9에서 효율적으로 반응

장점

• 비교적 반응 부산물 적음
• MS/MS에서 일관된 fragment 제공

주의사항

• 빛에 민감 → amber vial 사용
• 과량 사용 시 FMOC-OH 생성 → 피크 tailing 발생

2.3 PITC(Phenylisothiocyanate): 고전적이지만 여전히 유효

• Edman degradation에서 사용되던 시약
• amine group에 뛰어난 선택성
• 실무에서는 경구제·항암제 시료의 extractable amine 분석에서 아직도 사용됨

단점

• 냄새가 강하고 반응 시간 길다
• 스테로이드 분석에는 적합하지 않음

3. Carbonyl 계 분석물질: DNPH, Girard’s reagent, OPA 적용 전략

Carbonyl 기능기를 가진 약물 및 대사체는 LC-MS 분석에서 불안정한 경우가 많다. 유도체화를 통해 구조 안정성과 감도를 동시에 잡을 수 있다.

3.1 DNPH(Dinitrophenylhydrazine): aldehyde/ketone 특화 유도체화

장점

• 명확한 mass shift
• LC-UV/MS 모두에서 신호 증가
• aldehyde 계 대사체 구조 확인에 매우 유리

단점

• 반응 시간이 길다 (30~60분)
• hydrazone 형태가 isomerization 일으킬 수 있음
• 단일 피크 확보 어려울 수 있음 → HRMS 병행 권장

3.2 Girard’s reagent T/P: 스테로이드 carbonyl 유도체화의 표준

스테로이드 분석에서 가장 강력한 도구.

특징

• carbonyl group과 반응하여 quaternary ammonium 도입
  → ESI(+)에서 감도 50~200배 증가
• 수용성 증가 → sample prep 간소화
• isomer 분리가 용이

실제 적용 사례

• cortisol / cortisone 비율 측정
• prednisolone 대사체 profiling
• plasma·urine 몰농도 비교 시 감도 향상 확연함

3.3 OPA(Ortho-phthalaldehyde) + thiol 반응

• 빠른 반응(1~2분) → 고처리량 분석에 적합
• amine + carbonyl이 동시에 존재하는 구조에서 좋은 선택성
• fluorescence 기반 분석과 병행 가능

주의점

• 생성물이 불안정해 LC-MS에는 장시간 분석 부적합
• TDM 용보다는 screening 용도에 적합

4. Steroid 분석: derivatization이 사실상 필수인 영역

스테로이드는 이온화 효율이 극도로 낮고, 대사체도 다양해 분리도 쉽지 않다.
이 때문에 derivatization 기법 중에서도 가장 다양한 전략이 존재한다.

4.1 Picolinyl ester derivatization

원리

• hydrophobic 성분에 picolinic acid를 결합시키면
  → ESI에서 강한 negative ion 형성

장점

• 감도 10~100배 증가
• regioselective
• inter-individual variability 감소

실무 팁

• 반응 조건은 mild하나 시간이 길다(60–90분)
• 아세틸화 된 스테로이드는 예외적 반응 가능 → 사전 검증 필요

4.2 Amplifex Diene Reagent (pyridinium 기반)

최근 HRMS 기반 스테로이드 분석에서 가장 각광받는 시약.

장점

• quaternary ammonium 도입 → 극강의 ESI(+) 감도
• isomeric steroid 분리에 탁월
• low ng/mL → pg/mL 수준 LLOQ 달성 가능

국내 제약사 활용 시 기대 효과

• 스테로이드 기반 신약 후보군 early PK 연구에서 사용 가능
• TDM 플랫폼 구축에도 응용 가능

4.3 기타: dansyl chloride, Girard-T, pentafluorobenzylation

• 스테로이드 구조에 따라 선택적으로 적용
• 특히 pentafluorobenzylation은 APCI에서 signal gain이 매우 크다

5. LC-MS/MS 실무에서의 Derivatization 설계 체크리스트

아래 항목은 분석팀에서 실제 method development 시 반드시 검토해야 할 부분이다.
사용자 요청 기반으로 실무자 관점에 맞춰 세부화했다.

(1) 유도체화 반응성 확인

• 반응 위치가 명확한가?
• 경쟁 반응이 발생할 가능성은?
• 물질이 enolization 등으로 안정성이 떨어지는 구조 아닌가?

(2) Reaction yield 평가

• UPLC-UV로 부산물 profiling 진행
• 반응 후 quenching 및 cleanup 최적화
• LLE, SPE와 결합 시 recoveries 변화 체크

(3) LC-MS/MS transition 최적화

• derivatized ion은 parent과 fragmentation 패턴이 완전히 바뀜
• MRM transition은 반드시 zero-based로 새로 탐색해야 함
• polarity switching 시간도 재조정 필요

(4) Matrix effect 개선 여부 검증

• post-column infusion 필수
• IPP(internal peak profiling)으로 retention shift 여부 평가
• derivatization으로 인해 ion suppression peak가 이동했는지 재확인

(5) Stability 검증

• derivatized compound는 원물질보다 불안정한 경우가 있음
• freeze-thaw, bench-top, autosampler stability 모두 필수
• 특히 DNPH·OPA는 autosampler stability가 짧은 편

(6) Calibration curve linearity 확보

• derivatization efficiency variability → calibration reproducibility에 영향
• IS도 동일하게 유도체화되는 isotope-labeled version 사용 권장
• matrix-matched calibration이 기본

(7) TDM·PK용으로 적용하는 경우

• 대량 시료 처리 시 반응 batch 간 variability 증가
• HTS(high-throughput screening) 자동화 대응 필요
• sample prep robot 적용 시 quenching·mixing 단계 주의

6. 국내외 최신 동향: Derivatization + HRMS + AI workflow

최근에는 유도체화 중심의 분석법이 단순히 “감도 향상을 위한 트릭”이 아니라,
대사체 구조 동정·biotransformation profiling·unknown metabolite 분석과 결합하면서 전략적 도구로 발전하고 있다.

1) HRMS 기반 구조 동정

• derivatization 후 정확 질량이 크게 바뀌어 fragment interpretation 명료해짐
• 스테로이드나 carbonyl 대사체 profiling에 탁월

2) AI 기반 peak classification

• 유도체화 후 peak shape이 안정적이어서 AI가 더 정확하게 integration 가능
• 특히 multi-metabolite 분석에서 false peak 식별 정확도 증가

3) 국내 제약사 적용 사례

• 대사체 스크리닝 속도 3~5배 향상
• HRMS 라이브러리 활용 시 구조 동정 confidence level 상승
• micro-sampling 기반 소량 시료에서도 감도 확보

7. 결론: Derivatization은 여전히 강력한 ‘실무형 감도 향상 전략’

LC-MS/MS가 고성능화되었음에도 불구하고,
낮은 농도의 분석물질, 복잡한 biological matrix, 구조적으로 이온화가 어려운 물질을 분석해야 하는 상황에서는 derivatization은 여전히 가장 강력한 전략이다.

특히 amine, carbonyl, steroid 계는 각각 적합한 유도체화 시약이 잘 정립되어 있어
국내 제약사 분석팀에서도 쉽게 적용할 수 있다.