Clinical Trial Sample 분석에서 Incurred Sample Reanalysis(ISR) 실패 원인 분석

— 바이오애널리시스 품질의 진짜 핵심을 드러내는 “ISR 실패”의 본질

임상시험 시료 분석에서 ISR(Incurred Sample Reanalysis) 는 단순한 품질 지표가 아니다.
많은 분석자들이 말하듯 “ISR은 바이오애널리시스의 민낯을 드러내는 항목”이며, method validation 때는 몰랐던 숨겨진 문제들이 실제 임상 시료에서 폭발적으로 드러나기도 한다.

애초에 ISR이 필요한 이유도 여기에 있다.
검증된 분석법이 임상시험이라는 “현실적인 조건”에서 여전히 재현성이 있는지를 확인하는 절차이기 때문이다.

그러나 ISR 실패는 생각보다 흔하다. 국내 제약사 분석팀에서도 ISR 실패 때문에 다시 시료를 회수하고, 분석법을 재평가하거나, sponsor와 수차례 회의를 반복하는 일이 드물지 않다.

이 글에서는 ISR 실패가 실제로 왜 발생하는지, 그리고 실무적으로 어떤 지점에서 문제가 생기는지를 매우 현실적인 관점에서 짚어본다.

1. ISR이 실제 임상에서 잘 안 맞는 이유

— validation 시료와 incurred 시료는 “완전히 다른 세계”

많은 실무자들이 초기에 혼란스러워하는 부분이 있다.
“validation은 잘 됐는데 왜 ISR은 실패하지?”

그 이유는 간단하다.

✔ Validation sample ≠ Clinical incurred sample

• validation sample: 스파이크한 ‘인공적’ 시료
• clinical sample: 실제 환자 혈액·소변·조직 기반의 ‘생체 반응 결과물’

두 시료는 완전히 다르다.
임상 시료는 matrix composition이 사람마다 다르고, 질환 상태·약물 대사 속도·혈장 단백 농도 등도 크게 영향을 미친다.

즉, validation은 ‘실험실의 안정된 세계’이고 ISR은 실제 임상시험의 ‘혼란스러운 세계’다.

그래서 흔히 validation에서 전혀 문제가 없던 분석법이, 실제 시료를 만나면 신호가 흔들리거나, bias가 급증하며, S/N이 불안정해진다.

2. ISR 실패 기준 다시 정리

일반적으로 ISR acceptance 기준은 다음과 같다:

✔ Repeat results must be within 20% of the original value for ≥ 67% of ISR pairs

• 대부분 67% rule 적용
• 일부 프로젝트에서는 70% 또는 75% 기준을 요구하기도 함
• high variability drugs는 예외 규정 가능

ISR 실패는 보통 다음 형태로 나타난다:

• 특정 농도대에서 반복적으로 실패
• 환자군 특정 subgroup에서 실패
• 분석일자(batch) 간 실패
• 특정 분석자가 수행한 ISR만 실패
• 동일 환자 within-subject는 잘 맞는데 population 간 실패

이 패턴 자체가 ISR 실패 원인을 밝히는 단서가 된다.

3. ISR 실패 주요 원인 분석

이제 본론이다.
실제 실무에서 ISR을 실패하게 만드는 원인을 “분석 기술적 요인 / 임상 시료 특성 / 장비·운영 요인 / 사람 요인”으로 나누어 정리했다.

3-1. 분석 기술적 요인 (Analytical factors)

(1) Extraction recovery 변동

validation에서는 회수율이 안정적으로 보였더라도 실제 임상 시료는 다음 이유로 recovery가 변동된다.

• 단백 결합율(patient-specific) 차이
• lipidemia·hemolysis·icterus 등의 matrix variability
• 환자별 endogenous metabolites 경쟁 이온화

특히 고지혈증 환자(lipemic sample) 은 SPE·LLE 효율이 크게 떨어져 ISR mismatch가 빈번하다.

(2) Matrix effect variability

Matrix effect는 validation 때 평균적으로 정상값이 나오더라도,
임상 시료에서는 환자별로 suppression이나 enhancement가 크게 달라질 수 있다.

예시:

• ESRD 환자 → uremic toxin 증가 → ion suppression 증가
• 간질환 환자 → bilirubin 증가 → UV absorbance shift + MS 간섭 증가
• 항생제 co-medication → fluoroquinolone 등과 중복 이온간섭 발생

이런 matrix effect는 ISR에서 오리지널 값과 재분석 값이 20% 이상 차이로 이어진다.

(3) Calibration curve stability 문제

ISR 수행 시점은 보통 임상 분석의 중반~후반이다.
따라서 calibration standard 준비나 stock stability 이슈가 매우 큰 영향을 미친다.

주요 실패 요인:

• working standard 농도 변화
• stock solution freeze-thaw degradation
• calibrator carryover
• preparation day 간 variability

(4) Analyte stability 문제

임상 시료는 종종 장기간 storage를 거치게 된다.
이 과정에서 발생하는 analyte degradation은 ISR 불일치의 가장 흔한 원인 중 하나다.

원인 예:

• plasma esterase에 의한 분해
• light exposure
• repeated freeze-thaw
• sample handling delay

특히 불안정한 prodrug은 ISR mismatch가 매우 빈번하다.

3-2. 임상 시료 특성 (Clinical sample–based factors)

(1) patient-specific metabolism

동일 용량의 약물을 투여해도 환자 간 대사 패턴은 크게 달라진다.

• rapid metabolizer vs slow metabolizer
• 병용 약물
• 유전적 변이(CYP2D6, CYP3A5 등)
• organ impairment (renal/hepatic)

특히 metabolite ratio가 큰 폭으로 변하는 약물은 ISR mismatch 가능성이 높다.

(2) Hemolysis, lipemia, icterus

실제 ISR failure 보고서에서 가장 자주 등장하는 원인이다.

• hemolysis → hemoglobin 이온화 간섭
• lipemia → extraction recovery fall
• icterus → bilirubin 간섭

validation sample에서는 거의 재현되지 않는 문제들이다.

(3) 소량 시료(micro-sampling) 기반 분석

DBS, VAMS는 장점이 있지만 ISR variability가 크게 나타날 위험이 있다.

원인:

• hematocrit 효과
• sample spot homogeneity 문제
• pipetting error 증가
• extraction 효율 감소

3-3. 장비·운영(Operation) 요인

(1) LC-MS/MS sensitivity drift

일반적으로 가장 흔하지만 간과되는 원인이다.

• ESI source contamination
• cone/orifice fouling
• pump pressure fluctuation
• autosampler carryover
• column aging

특히 LC column 성능 저하로 RT shift가 발생하면 ISR mismatch가 매우 높아진다.

(2) Batch effect

ISR은 보통 다른 날짜 또는 다른 batch에서 분석한다.
이때 batch 간 variability가 관용 범위를 넘을 수 있다.

주요 원인:

• mobile phase 제조일 차이
• column lot 변경
• extraction 환경 온도 변화
• internal standard variation

(3) Instrument-to-instrument variation

두 대 이상의 LC-MS/MS를 사용하던 시기라면
장비 간 sensitivity 차이로 ISR mismatch가 발생한다.

특히:

• dwell time 차이
• collision energy 미세 차이
• source temperature 조절 실패
• vacuum level drift

3-4. 사람(Human factor) 요인

(1) pipetting error

임상 ISR은 대부분 low volume sample이다.
따라서 pipetting 5–10 µL error도 결과에 큰 영향을 준다.

(2) training level

초보 분석자가 ISR을 수행할 경우:

• sample mixing 부족
• extraction vortex 시간 미준수
• autosampler injection order 오류 등이 발생

(3) sample handling mistake

• thaw 후 vortex 미흡
• hemolysis 발생
• tube-change 시 loss 발생

4. ISR 실패 패턴별 원인 추적 방법

현장에서 가장 도움이 되는 내용이다.
ISR mismatch 패턴을 보면 원인을 추정할 수 있다.

(1) 낮은 농도 구간에서만 mismatch

→ sensitivity 문제 or background matrix effect

• LLOQ 근처에서 흔함
• extraction variability가 주요 원인

(2) 높은 농도 구간에서만 mismatch

→ sample dilution·stability 문제

• dilution integrity 문제가 원인일 확률 높음

(3) 특정 환자군에서만 mismatch

→ matrix variability

• 간질환, 신질환, 항생제 병용 환자 등

(4) 특정 분석자·특정 batch에서만 mismatch

→ human error or batch effect

(5) metabolite-rich sample mismatch

→ metabolism variability

• prodrug or extensive metabolizer case에서 자주 발생

5. ISR 실패 시 실무자가 취해야 할 조치

ISR이 실패했다고 해서 무조건 분석법 전체를 폐기해야 하는 것은 아니다.
아래 단계별 접근이 필요하다.

(1) Sample integrity 체크

• freeze-thaw 횟수
• hemolysis 여부
• sample storage 온도
• sample transfer 기록

(2) Extraction & matrix effect 재평가

• post-column infusion 재실시
• patient-specific matrix pool 분석
• SPE/LLE 조건 재조정

(3) Standard & IS 재검증

• stock solution degradation test
• isotope-labeled IS 반응성 확인

(4) LC-MS/MS 장비 상태 재점검

• cleaning
• tune/Cal check
• column 교체

(5) partial validation 또는 extended validation

문제 구간에 대한 추가 검증 단계 필요.

(6) 임상팀과의 커뮤니케이션

ISR failure는 단순 분석팀의 문제가 아니라
clinical study 전체의 데이터 신뢰성 문제이므로
CRA/DM/PK 팀과의 커뮤니케이션이 필수이다.

6. 결론 – ISR은 분석법의 ‘진짜 안정성’을 드러내는 마지막 시험

ISR 실패는 분석팀에게 꽤 부담이 되는 이벤트지만,
실제로는 해당 분석법이 “임상 시험”이라는 실전 환경에서도 견고한지를 보여주는 가장 중요한 지표다.

다시 말하면, ISR은 validation보다 더 현실적이며,
임상 데이터의 신뢰성과 규제기관 제출의 품질을 결정하는 핵심 요소다.

ISR 실패는 결코 분석자의 잘못이 아니라,
“분석법이 실제 사람의 생리적 변이를 감당할 수 있는가”를 점검하는 필연적 절차다.

분석팀이 이점을 이해하고 시스템적으로 대응하면
ISR 실패가 오히려 method robustness를 강화하는 중요한 기회가 된다.

 

Clinical Trial Sample 분석에서 Incurred Sample Reanalysis(ISR) 실패 원인 분석